蔣 萍，蔚 芃，趙明才，陳 瓊，王 梓(川北醫學院附屬醫院骨科，四川省南充市 637000)
蔣萍，女，1983 年生，四川省南充市人，漢族，2012年川北醫學院畢業，碩士， 醫師，主要從事骨與關節損傷修復研究。
通訊作者：蔚芃，主任醫師，川北醫學院附屬醫院骨科，四川省南充市637000
文章亮點：
1.膠原蛋白作為天然高分子生物材料已被證實可作為軟骨組織工程支架材料，并且它作為底物能刺激軟骨細胞生長，可用于體外軟骨細胞培養，但關于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭議。
2.實驗創新性使用Ⅰ、Ⅱ型膠原包被培養板和普通培養板同時培養人軟骨細胞，研究Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學特性的影響。發現膠原蛋白包被培養板培養軟骨細胞優于普通培養板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養板在培養軟骨細胞時更能維持細胞形態，延長去分化現象出現的時間，更利于細胞再分化。
關鍵詞：
生物材料；軟骨生物材料；Ⅰ型膠原蛋白培養板；Ⅱ型膠原蛋白培養板；人軟骨細胞；體外培養
主題詞：
膠原Ⅰ型；膠原Ⅱ型；軟骨細胞
基金資助：
四川省衛生廳項目
摘要
背景：實驗證明膠原蛋白底物具有刺激成軟骨的作用，但關于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭議。
目的：觀察Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對體外培養人軟骨細胞生物學特性的影響。
方法：將 P3 代人軟骨細胞分別加入普通培養板、Ⅰ型膠原蛋白包被培養板、Ⅱ型膠原蛋白包被培養板繼續培養。培養 10 d 內，MTT 法繪制細胞生長曲線；培養 28 d 后，采用 ELISA 法、聚合酶鏈反應、二甲基亞甲基藍比色等方法檢測 3 種培養板中軟骨細胞分泌Ⅰ膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白及糖胺多糖的量。
結果與結論：Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞數量最多，增殖速度為Ⅰ型膠原蛋白包被培養板的 2 倍、
普通培養板的 5 倍。Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白最少，與普通培養板板檢測結果差異有顯著性意義(P < 0.01)，與Ⅰ型膠原蛋白包被培養板檢測結果差異無顯著性意義；Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白、糖胺多糖最多，與其他兩種培養板檢測結果差異有顯著性意義（P < 0.01）。表明膠原蛋白包被培養板培養軟骨細胞優于普通培養板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養板在培養軟骨細胞時更能維持細胞形態，延長去分化現象出現的時間，更利于細胞再分化。
蔣萍，蔚芃，趙明才，陳瓊，王梓.Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學特性的影響[J].中國組織工程研究，
2014，18(30):4845-4850.
Effect of type I or type II collagen on biological characteristics of human chondrocytes
Jiang Ping, Master, Physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Corresponding author: Wei Peng, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Accepted: 2014-05-21
Jiang Ping, Wei Peng, Zhao Ming-cai, Chen Qiong, Wang Zi (Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Experiments have shown that the collagen substrate has the capability of stimulating cartilage generation, but the stimulating role of different types of collagen substrates remains controversial.
OBJECTIVE: To investigate the effect of type I and type II collagen on the biological characteristics of human chondrocytes cultured in vitro.
METHODS: Human chondrocytes at passage were cultured onto the ordinary culture plates (ordinary plate), type I collagen-coated culture plates (type I plate), and type II collagen-coated culture plates (type II plate). Cell growth curves were determined by MTT method after cells were cultured for 10 days. By ELISA, PCR, and 1,9-dimethyl methyleneblue technology, type I and type II collagen and glycosaminoglycan contents were quantitatively detected in cartilage cells 28 days after culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of cartilage cells was the highest in type II plate, which was twice of that in type I plate and five times of that in ordinary plate. Cartilage cells in type II plate secreted the least amount of type I collagen, which showed significant differences compared with the ordinary plate (P < 0.01) and had no statistically significant difference with type I plate (P > 0.01). Cartilage cells in type II plate secreted the most amount of type II collagen and glycosaminoglycan, showing significant differences compared with the other two plates (P < 0.01). The cartilage cells cultured in collagen plates are better than that cultured in ordinary culture plate, type II collagen culture plate is better than type I collagen culture plate in maintaining cell shape, extending the dedifferentiation pattern, and promoting cell differentiation.
Subject headings: collagen type I; collagen type II; chondrocytes
Funding: a grant by Sichuan Provincial Health Ministry
Jiang P, Wei P, Zhao MC, Chen Q, Wang Z. Effect of type I or type II collagen on biological characteristics of human chondrocytes. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(30):4845-4850.
引言
隨著組織工程學的發展，軟骨組織工程學為人們提供了更為理想的修復關節軟骨缺損方法。如何獲得大規模具有增殖活性的種子細胞為當前面臨的最大限制因素之一。
1994年Brittberg[1]體外培養患者健康軟骨細胞，獲得大量純化軟骨細胞，再移植到其關節軟骨缺損部位治療關節軟骨缺損，開創了應用自體軟骨細胞移植治療軟骨損傷的新技術。該技術在1997年得到美國FDA正式批準后已在歐洲國家廣泛使用，獲得大量純化且具有再生活力的軟骨細胞是該技術的關鍵，但在實驗過程中發現軟骨細胞體外培養傳代會發生去分化現象，喪失成軟骨能力。
為了解決體外培養軟骨細胞的去分化現象，越來越多的研究被報道，早在1975年就有實驗證明膠原蛋白底物具有刺激成軟骨的作用[2]。膠原也稱膠原蛋白，是脊椎動物體內的一種結構蛋白，人體內含量非常豐富，占動物體膠原纖維固體物的 80%-90% ，占體內蛋白質總量的25%-30%，也是細胞外基質的主要成分[3]。由于膠原蛋白是天然的生物資源，來源廣泛且具有獨特的生物相容性、可降解性、低免疫原性，還有如高拉伸強度、止血性能及促進細胞生長等獨特的性能，被越來越重視。由于膠原蛋白具有止血、促進組織再生和功能恢復的作用，被制成海綿、絲線、薄膜等醫療器械用于普外科、口腔、血管外科等多個科室，同時也因其組織相容性、可降解性被作為皮膚移植材料用于燒傷、創傷的修補。19世紀80年代，Zyderm膠原植入物被作為一種注射型膠原蛋白制劑在臨床上開始使用，在治療面部軟組織變形方面已使用近30年[4]。人們成功將膠原蛋白制成各種各樣的組織工程支架，如皮膚、骨組織、氣管和血管支架，Award等[5]混合自體同源間葉細胞的莖狀細胞和膠原蛋白凝膠制作肌腱用于腱后修復。
Wakitani等[6]用嵌入軟骨細胞的膠原蛋白凝膠修復軟骨缺
陷。膠原蛋白作為天然高分子生物材料已被證實可作為軟骨組織工程支架材料，并且它作為底物能刺激軟骨細胞生長，可用于體外軟骨細胞培養，但關于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭議。本實驗使用Ⅰ、Ⅱ型膠原包被培養板和普通培養板同時培養人軟骨細胞，研究
Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學特性的影響。
材料和方法
設計：前瞻性實驗。
時間及地點：于2008年1月至2009年4月在川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所完成。
材料：收集川北醫學院附屬醫院骨科因股骨頸骨折行
全髖置換20例患者的股骨頭標本，患者年齡56-84歲，平均66歲。供者對實驗均知情同意并簽署知情同意書。
實驗方法：
軟骨細胞的分離及培養：將收集的關節軟骨以體積分 數75%乙醇消毒后，用手術刀片刮除關節表面軟組織及可能覆蓋在其上的滑膜，再將關節表面軟骨薄層組織削下來， 使削下的軟骨組織盡量薄，不能削到軟骨下骨。將收集的軟骨組織片放入裝有含青霉素(100 U/mL) 、鏈霉素(100 U/mL)的PBS中漂洗3次，洗去軟骨表面血液及可能存在的滑膜，然后移入小玻璃瓶里，剪成1.0-2.0 mm3，在含雙抗的PBS清洗后轉入50 mL離心管內，加入0.2% Ⅱ型膠原酶2 mL消化。將消化后的軟骨組織和液體通過200目金屬篩網，將未消化的軟骨組織殘渣放入50 mL離心管中， 加入Ⅱ型膠原酶及DMEM繼續消化，根據消化程度決定消化時間，但消化時間最長不超過12 h為宜。過濾得到的液體放入15 mL離心管中，1 000 r/min離心7 min，去上清， 加DMEM吹打，盡量輕柔，再次1 000 r/min離心7 min后棄去上清，反復清洗3次洗去Ⅱ型膠原酶。將錐蟲藍檢測活力大于95%的原代軟骨細胞以4×108 L-1濃度接種于25 cm2塑料培養培養瓶。待軟骨細胞長滿培養瓶85%以上，棄原培養液，PBS清洗3次，加2.0-3.0 mL含EDTA的0.25%胰酶
(以剛好覆蓋培養瓶底為宜)消化2 min，鏡下觀察貼壁細胞變圓脫落，待細胞大部分脫落后，加入含胎牛血清的培養液終止消化。將消化下的細胞懸液用培養液混勻后移入15 mL離心管，1 000 r/min離心7 min，棄上清，加含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液制成細胞懸液，計數細胞，按1∶2接種于兩個25 cm2培養瓶中，繼續培養箱培養， 記錄P0-P7代軟骨細胞形態變化，使用選擇培養后細胞形態正常、活性強的10組軟骨細胞進行實驗，選擇開始出現去分化現象的P3代軟骨細胞進行實驗。
Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白培養板的制備：選擇可用于包被培
養培養板的Ⅰ型(C3867，sigma)、Ⅱ型(C9301，sigma) 膠原蛋白，以1%濃度，按8 μg/cm2分別包被培養板記為Ⅰ 型板、Ⅱ型板。
不同培養板對軟骨細胞生物學特性的影響及軟骨細胞在3種培養板的體外擴增增殖速度：將P3代軟骨細胞以2×107 L-1的細胞濃度分別接種于普通培養板、Ⅰ型板、Ⅱ 型板，放入孵箱繼續培養10 d。
使用MTT法繪制細胞生長曲線，準備新的96孔板，在同一96孔板分3區，每一區32孔，按上述方法鋪上膠原蛋白分別為Ⅰ型板、Ⅱ型板、普遍板。將第3代軟骨細胞以
1×103接種于3區，每孔加入含胎牛血清、青霉素、鏈霉素
圖 1 人軟骨細胞的培養(倒置相差顯微鏡)
Figure 1 The culture of human cartilage cells (inverted phase contrast microscope)
圖注：圖中A、B 為第 3 代貼壁軟骨細胞，以長橢圓形為主；C、D 為第 7 代貼壁軟骨細胞，明顯類似于成纖維細胞。
圖 2 將人軟骨細胞培養于不同培養板 10 d 后的細胞形態
Figure 2 Morphology of cartilage cells cultured in different culture plates for 10 days
圖注：圖中A、B 為普通培養板，細胞數量少，多為梭形，細胞出現較多分叉，細胞核不明顯，無明顯分裂增殖相；C、D 為Ⅰ型膠原蛋白包被培養板，細胞外觀立體，表面膠原蛋白覆蓋，細胞數多且細胞短于普通培養板，分叉細胞較少，具有分裂增殖能力；E、F 為Ⅱ型膠原蛋白包被培養板，細胞數量最多，外觀立體，表面膠原蛋白覆蓋，無明顯分叉細胞，細胞核明顯，具有較強的分裂增殖能力。
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圖 3 在不同培養板上培養人軟骨細胞的生長曲線 Figure 3 Growth curves of human chondrocytes cultured in various culture plates 圖注：第 2 天即進入對數生長期，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中的軟骨細胞增殖快于普通培養板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中的軟骨細胞增殖速度最快。在培養第 8 天時，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中的軟骨細胞增殖緩慢，進入平臺期。培養第 10 天時Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞仍多于另外兩種培養板。 |
圖 4 不同培養板中人軟骨細胞培養上清液的Ⅱ型膠原基因表達量Figure 4 Type II collagen gene expression profile in cartilage cell culture supernatant of different plates 圖注：圖中 1 為普通培養板，2 為Ⅱ型膠原蛋白包被培養板，3 為Ⅰ 型膠原蛋白包被培養板。Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞Ⅱ型膠原蛋白基因表達最高，Ⅰ型膠原蛋白包被培養板其次，最少的為普通培養板。 |
表 1 不同培養板中人軟骨細胞培養上清液Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白，Ⅱ型膠原基因表達量及糖胺多糖的水平
Table 1 Type I and type II collagen protein, type II collagen gene
expression, and glycosaminoglycan contents in cartilage cell
| 組別 | Ⅰ型膠原蛋白(mg/L) | Ⅱ型膠原蛋白(mg/L) | Ⅱ型膠原基因表達量（灰度比值） | 糖胺多糖(mg/L) |
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普通培養板組 |
308.42±50.85 | 69.88±5.48 | 0.33±0.09 | 1.31±1.23 |
| Ⅰ型膠原蛋白 | 165.03±69.32a | 85.97±10.34a | 0.63±0.08a | 3.37±1.64a |
| 包被培養班組 | ||||
| Ⅱ型膠原蛋白 | 118.09±45.73a | 97.46±9.39ab | 0.80±0.06ab | 4.55±0.87ab |
| 包被培養板組 |
表注：與普通培養板比較，aP < 0.01；與Ⅰ型膠原蛋白包被培養板組比較， bP < 0.01。結果顯示Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白、糖胺多糖最多。
的培養液共200μL。放入37 ℃、體積分數5%CO2、95% 濕度的孵箱繼續培養10 d，根據軟骨細胞生長速度，檢測2， 4，6，8，10 d軟骨細胞吸光度值，每天各個區測4孔。每孔加入配置好的MTT 20 μL，繼續放入孵箱培養4 h，終止培養后小心吸棄培養液，每孔加入DMSO 150 μL，搖床振蕩10 min使結晶充分溶解，酶標儀選擇570 nm檢測吸光度值，繪制細胞生長曲線。
培養28 d后，采用ELISA法檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量，按ELISA試劑盒說明進行操作。在450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(A值)。依據標準品濃度對應的A值計算出標準的直線回歸方程，再根據樣品的A值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。
培養28 d后，采用反轉錄-聚合酶鏈式反應測定Ⅱ型膠原蛋白基因表達。按照Trizol總RNA提取試劑說明書提取軟 骨細胞總RNA，用凝膠電泳檢測提取總RNA純度，選擇純度較高的RNA使用反轉錄試劑盒進行反轉錄-聚合酶鏈式反應，根據GeneBank中Ⅱ型膠原cDNA序列，用Primier
5.0軟件設計引物，由北京賽百盛基因有限公司合成。Ⅱ型膠原，上游引物：5-TCC TCT GCG ACG ACA TAA-3，下游引物：5-CAG TGG CGA GGT CAG TT-3。產物大小為108 bp，內參基因GAPDH為試劑盒自帶?；靹驑吮?，瞬時離心后放入PCR儀器中，設置參數為94 ℃預變性5 min, 94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃ 再延伸5 min，共35個循環。選擇1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，根據凝膠自動成像分析儀掃描成像，觀察電泳條帶的灰度值，應用相應軟件根據目的基因與內參照基因的條帶灰度比值表達產物進行Ⅱ型膠原蛋白半定量分析。
培養28 d后，采用二甲基亞甲基藍比色法定量檢測糖胺多糖含量，按照試劑盒說明書操作進行。
主要觀察指標：3種培養板中軟骨細胞分泌Ⅰ膠原蛋 白、Ⅱ型膠原蛋白及糖胺多糖的量。
統計學分析：實驗數據采用x±s
表示，采用SPSS 17.0
Hunter[7]認為軟骨受到損傷無法修復，隨著科學技術的
分析軟件對實驗數據進行處理，用單因素方差分析法和q 檢驗對數據進行檢驗，P < 0.01為差異有顯著性意義。
結果 Results
2.1 倒置相差顯微鏡觀察軟骨細胞形態
軟骨細胞培養：貼壁的原代軟骨細胞呈橢圓形、多角 形；傳代軟骨細胞較原代細胞稍大，呈橢圓形、多角形或者不規則形；P3代軟骨細胞和P1、P2代細胞相似，但細
胞逐漸伸展，變成以長橢圓形為主(圖1A，B)；傳至P7代
軟骨細胞明顯類似于成纖維細胞(圖1C，D)。
不同培養板培養的軟骨細胞形態：培養10 d后，普通板中軟骨細胞數量少，形態多為梭形，較細長(圖2A)；細胞出現較多分叉，細胞核不明顯，無明顯細胞分裂增殖相(圖2B)。Ⅰ型板細胞表面被膠原蛋白纖維覆蓋，細胞外觀立體，細胞數多且細胞短于普通板(圖2C)，具有分叉的細胞較普通板少，分叉的細胞分支較少，60%細胞核明顯， 具有分裂增殖能力(圖2D)。Ⅱ型板軟骨細胞數明顯較多， 約長滿培養板90%，且多為短小細胞，同Ⅰ型板細胞一樣， 細胞外觀立體，表面膠原蛋白覆蓋(圖2E)，短小細胞占
2.2不同培養板中軟骨細胞的增殖速度 觀察細胞生長曲線(圖3)，第2天即進入快速生長的對數生長期。Ⅰ、Ⅱ 型板中的軟骨細胞增殖快于普通板，其中Ⅱ型板中的軟骨細胞增殖速度最快，為Ⅰ型板的2倍、普通板的5倍。在培養第8天時，Ⅰ、Ⅱ型板中的軟骨細胞增殖緩慢，進入平臺期，考慮細胞增殖快，接觸抑制。由于Ⅱ型板中軟骨細胞個體小于Ⅰ型和普通板，故培養第10天時Ⅱ型板中軟骨細胞仍多于另外培養板。
2.3不同培養板對軟骨細胞生物學特性的影響
軟骨細胞分泌Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白水平及定量檢測：3 種培養板中軟骨細胞Ⅰ型膠原蛋白分泌量的差異均有顯著性意義(P < 0.01，表1)，再使用q檢驗進行兩兩比較顯示， 普通板中軟骨細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白量高于Ⅰ、Ⅱ型板， 但不能認為Ⅰ、Ⅱ型板中軟骨細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白量不同。3種培養板中軟骨細胞Ⅱ型膠原蛋白分泌量差異有顯著性意義(P < 0.01)，使用q檢驗進行兩兩比較后，顯示Ⅰ、
Ⅱ型板中軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白量均高于普通板，其中Ⅱ型板中軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白量最高。根據半定量PCR檢測也得出Ⅱ型板中軟骨細胞Ⅱ型膠原蛋白基因表達最高，Ⅰ型板其次，最少的為普通板(圖4)。
軟骨細胞分泌糖胺多糖的量：3種培養板中軟骨細胞糖
胺多糖分泌量差異有統計學意義(P < 0.01)，使用q檢驗進行兩兩比較后顯示，Ⅰ、Ⅱ型板中軟骨細胞分泌糖胺多糖都高于普通板，其中Ⅱ型培養板中軟骨細胞分泌量最高(表1)。
討 論 Discussion
Hunter認為軟骨受到損傷無法修復，隨著科學技術的發展和組織工程學的興起，對關節軟骨缺損的修復取得了一定進展，從促進軟骨修復逐漸發展到促進軟骨重建，如何獲
得足量的健康種子細胞及支架材料仍是研究的關鍵所在。獲得足量的種子細胞主要通過體外培養，軟骨細胞仍然
是研究的主要細胞[8]，目前軟骨細胞的體外研究主要集中在兔關節軟骨細胞的培養及誘導成模，動物的骨細胞往往增生活躍，并且由于種屬間差異，只能從一定程度上說明研究的意義，本實驗選擇直接從臨床上獲得的人關節軟骨細胞進行研究，更符合人實際生理狀態，更能指導臨床應用。關節軟骨細胞成分較單一，通過消化分離可以獲得高純度的軟骨細胞[9]。本實驗根據Tew等[10]報道使用DMEM配置的0.2%Ⅱ型膠原酶一步法消化軟骨組織獲得軟骨細胞，避免了多種酶對軟骨細胞的毒性，同時獲得大量具有活力的軟骨細胞。通過實驗發現軟骨細胞經過3次傳代后逐漸失去其原來的形態， 出現去分化現象，這與報道相同[11-13]，Watt [14]認為，軟骨細胞梭形變與細胞表型上的去分化有關，是判斷軟骨細胞表型是否改變的主要指標，選擇開始有去分化趨勢的P3代軟骨細胞進行實驗，能了解不同培養板對軟骨細胞去分化趨勢的影響。如何利用少量軟骨組織獲得多數量、高活性、具有分化能力的種子細胞，是目前關節軟骨組織工程制備技術中的重要問題之一[15-16]。
對去分化軟骨細胞再次恢復增殖活性和細胞表型的能力即再分化進行了研究，將已經去分化的軟骨細胞加入三維立體空間培養可以維持甚至恢復細胞的特性[17]。如何將單層培養獲得軟骨細胞與三維立體空間相結合培養軟骨細胞，值得深入討論[18]。應用于關節軟骨修復重建的材料主要有人工合成材料(PGA、PLA、PLGA等)、天然材料(膠原蛋白、瓊脂糖、海藻酸鈉等)[19-22]，其中天然材料膠原蛋白凝膠[23]、膠原蛋白海綿應用廣泛[24]。但在臨床研究中發現軟骨細胞在Ⅰ型膠原蛋白中仍會發生去分化現象，最終形成纖維軟骨，而非透明軟骨；環境因素對維持軟骨細胞的表型至關重要[25-26]，研究發現軟骨細胞基質中最多的Ⅱ 型膠原蛋白能維持軟骨細胞的形態，增進Ⅱ型膠原蛋白及聚合素的合成[27-28]，同時發現軟骨細胞在Ⅱ型膠原蛋白凝膠里分泌糖胺多糖及細胞因子增加。
本實驗在相同條件下比較了普通板、Ⅰ型膠原蛋白包被板、Ⅱ型膠原蛋白包被培養板對軟骨細胞體外培養的影響， 了解Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白哪種更能維持細胞活性和表型，使細胞大量擴增。通過細胞計數發現，隨著軟骨細胞傳代次數增加，同等面積收獲軟骨細胞數逐漸減少，考慮因細胞增殖活性減低，而且隨著去分化現象的出現，細胞伸展，變為細長， 增加了每個細胞所占面積，細胞的接觸抑制也使單位面積細胞數減少。高濃度細胞培養有益于細胞表型的維持[30]。膠原蛋白與細胞有交互作用，能幫助細胞聚集貼附，故膠原包被培養板貼壁細胞多，膠原蛋白和軟骨細胞相結合形成許多交錯網狀結構，在鏡下觀察可見軟骨細胞鑲嵌于膠原蛋白中。觀察細胞形態及增殖速度可以看出，Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞較Ⅰ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞形態小、分叉細胞少、具有分裂增殖活性的細胞多，增殖速度明顯快于另兩個培養板。
細胞外基質是軟骨細胞生長和代謝的場所，同時軟骨細胞也能合成和分泌細胞外基質，是評價細胞生物學功能活性的主要指標[31-32]。Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖是兩大特異性基質成分[33-34]，可以通過檢測其含量來判斷軟骨細胞是否具有分化能力。由于軟骨細胞發生去分化現象時分泌Ⅰ型膠原蛋白而不是Ⅱ型膠原蛋白[35-37]，可以通過測量軟骨細胞分泌Ⅰ 型膠原蛋白的量來了解軟骨細胞的去分化趨勢。通過ELISA 檢測發現，普通培養板中軟骨細胞分泌以Ⅰ型膠原蛋白為主，提示經過3次傳代體外培養的軟骨細胞開始出現去分化趨勢。P3代軟骨細胞在Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中繼續培養后分泌Ⅰ型膠原蛋白的量明顯少于普通板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中Ⅰ型膠原蛋白分泌量為普通板的一半，提示兩種膠原蛋白均能延長軟骨細胞出現去分化現象的時間，而該作用在Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白之間比較沒有明顯差異。
Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白包被培養板中軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白明顯多于普通板，其中以Ⅱ型膠原蛋白包被板明顯，提示有去分化趨勢的軟骨細胞在膠原包被培養板(特別是Ⅱ型膠原 蛋白)中繼續培養后，軟骨細胞分化能力強于普通板，說明Ⅱ 型膠原蛋白包被培養板能增強軟骨細胞繼續分化增殖的能力。本實驗中有去分化趨勢的軟骨細胞接種于膠原包被培養板繼續培養后，雖然軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白明顯增加， 但仍是以分泌Ⅰ型膠原蛋白為主，提示細胞的再分化只有經過長時間培養才會完成，與Binette等[38-39]研究相同。
本實驗發現膠原蛋白和軟骨細胞有交互作用，膠原蛋白包被的培養板應用于原代軟骨細胞體外培養時能使細胞盡早貼壁，減少懸浮死細胞量。膠原蛋白包被培養板培養軟骨細胞優于普通培養板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養板在培養軟骨細胞時更能維持細胞形態，延長去分化現象出現的時間，更利于細胞再分化。實驗為后期進行軟骨細胞在Ⅱ型膠原蛋白凝膠里進行三維立體培養，甚至軟骨細胞-Ⅱ型膠原蛋白凝膠復合物臨床實驗奠定了基礎。
致謝：感謝川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所提供實驗室及實驗室老師提供的實驗技術支持。
作者貢獻：蔚芃進行實驗設計、審校稿件，蔣萍完成了資料收集、實驗實施及最終成文，對文章負責，趙明才完成了實驗評估及實驗技術指導，陳瓊、王梓幫助完成了實驗數據統計、分析。
利益沖突：文章及內容不涉及相關利益沖突。
倫理要求：采用川北醫學院附屬醫院骨科行人工股骨頭置換 后丟棄的股骨頭標本進行實驗，患者均知情，川北醫學院附屬醫院為三級甲等醫院，具有完成該手術及進行實驗的條件、資質。學術術語：膠原蛋白-是脊柱動物含量最多、分布最廣的蛋白
質，在體內具有廣泛的生物學活性；體外應用具有低免疫原性、良好的生物相容性、可降解性、可參與組織修復重建等優越性， 是最重要的天然可降解的生物醫用材料。
作者聲明：文章為原創作品，無抄襲剽竊，無泄密及署名和
專利爭議，內容及數據真實，文責自負。
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