朱菡1，王夢1，趙成軍，李若松，楊娟1，裴廣暢1，葉婷2，左學志2，劉柳1，Octavia LS Chong Lee Shin1，朱鳳鳴1，孫潔2，徐虎子1，趙志1，曹楚瑾1，王玉璽1，楊倩1，徐鋼1，曾銳1，姚穎1,2

 

華中科技大學同濟醫學院 同濟醫院 1腎臟科、2營養科，中國，湖北，武漢，解放大道1095；

3武漢和格生物技術有限公司，中國，湖北，漢陽大道630號

 

收到 2018.01.20  接收 2018.04.06  電子版 2018.06.15  刊出 2018.06.30

 

摘要：粘多糖（GAG），作為II型膠原蛋白的組成部分，其與骨代謝有著相對緊密的關系。事實證明，復合骨膠原能促進骨小梁結構的連接。然而，確切的機制尚不清楚。在本文中，我們旨在確定復合骨膠原對糖皮質激素誘發的骨質疏松的具體影響和機制。在60天內，每天用GAG灌胃。結果表明，復合骨膠原對糖皮質激素引起的骨質疏松癥具有保護作用。在使用復合骨膠原治療后，小梁的數量和連接密度增加。我們生成了骨髓來源的巨噬細胞，以探索復合骨膠原對破骨細胞分化的影響。我們收集了存在于巨噬細胞群刺激因子（M-CSF）和核因子-kB配體受體激動劑（RANKL）中的細胞蛋白和RNA，發現了復合骨膠原抑制了NF-kB和MAPK通路，從而下調破骨細胞分化分子，例如：基質金屬蛋白酶（MMP 9）和活化T細胞、胞質1的核因子（NFATc-1）。我們的研究結果表明，復合骨膠原在臨床環境中可能具有治療糖皮質激素導致的骨質疏松癥的治療潛力。

關鍵詞：糖皮質激素，骨質疏松癥，復合骨膠原，NF-kB和MAPK通路

 

簡介

慢性腎臟疾?。–KD）的特點是腎結構和各種原因引起的功能在幾個月或幾年的時間里逐步喪失，通常大于3個月。中國的一個現況研究顯示，10.8%的中國人患有CKD；即，中國的CKD患者數量估計大約為1億1950萬人。糖皮質激素（GCs）由于其高抗炎和免疫抑制作用，是CKD患者中最常用的藥物之一。然而，長期和高劑量的使用可以使患者重新出現大量的不良并發癥包括糖皮質激素引起的骨質疏松癥（GIOP）。

GIOP是最常見的繼發性骨質疏松癥，其特點是骨質疏松、骨強度降低，骨折風險增加。GCs的內源性和生理濃度對成骨細胞的分化和激活起到了積極的作用，促進了生理骨形成過程。相反，接受GCs藥物治療的患者則會經歷一種非常繁瑣的體驗。一些對GC敏感的患者在長期和高劑量的GC治療后甚至不能正常行走或站立，因此他們的生活質量很低。研究表明，GCs破壞了成骨細胞、骨細胞和破骨細胞活動的平衡，導致骨質疏松。成骨細胞和骨細胞數量和活動的減少或破骨細胞數量和活動的增加改變了骨形成和骨吸收之間的平衡，最終導致骨質疏松。

NF-kB通道和它的下游分子，例如MMP 9，CTSK和NFATc-1，被認為是與GIOP密切相關的關鍵監管機構。這些下游分子的過表達促進骨髓巨噬細胞分化成破骨細胞，從而導致骨質疏松。

II型膠原蛋白是一種主要表現在皮膚和骨骼中的蛋白質。膠原纖維，彈性蛋白和粘多糖（GAG），這些成分相互交織形成一個與骨密度相關的網狀結構，從而增加骨的質量和強度。特別是GAG，被用作是測量II型膠原蛋白和骨代謝的重要標志。然而，相關機制尚不清楚。

在這項研究中，我們旨在確定在破骨細胞生成過程中，復合骨膠原對骨骼過程的影響。復合骨膠原抑制了GC引起的骨質疏松癥，該骨質疏松癥是通過NF-kB和MAPK通道促進破骨細胞相關分子MMP 9、CTSK和NFATc-1，導致的破骨細胞分化。復合骨膠原抑制GCs-介導破骨細胞生成，通過這種方式抑制了GC誘發的骨質疏松癥。

 

原料和方法

制備純復合骨膠原溶液

通過復合骨膠原片劑（武漢和格生物技術有限公司）制備復合骨膠原溶液。片劑溶解于蒸餾水中濃度為10%（10g/100ml）；PH值調制7.0。最后，該溶液通過防細菌過濾器過濾，以保持無菌。

 

動物和處理

雄性C57bl/6小鼠（8周大，重25g）是從北京華富康實驗動物技術有限公司（北京，中國）購買的。在同濟醫學院動物護理病房，動物們適應了特定的無病原體（SPF）條件下的居住環境。動物被保存在22攝氏度的溫度環境中，有12 h/12 h的光/暗周期，持續10周，直到4.5個月大。從美國的Innovative Research（IRA，佛羅里達，美國）購買了安慰劑和氫化潑尼松緩釋球團。動物被隨機分為四個實驗組：正常組（沒有特殊的干預），安慰劑組（給小鼠皮下植入7.5mg的安慰劑，60天緩釋），氫化潑尼松組（給小鼠皮下植入7.5mg的氫化潑尼松，60天緩釋），GAG組（給小鼠皮下植入同等劑量的氫化潑尼松緩釋團，同時給其灌胃復合骨膠原溶液）；每組6-8只小鼠。我們選擇的是總劑量為7.5mg，釋放期為60天的球團做研究。通過注射1%的戊巴比妥鈉（0.008ml/每克身體重量）使小鼠麻醉。然后，在肩胛骨上方創建合適的地方來植入緩慢釋放安慰劑和氫化潑尼松的球團。手術后，復合骨膠原溶液的劑量為每克身體重量0.45mg/day。60天后，頸椎脫位處死小鼠。我們在60天后沒有發現任何的球團。手機股骨、脛骨和血液做進一步分析。所有的實驗程序都是按照國家衛生研究院的指導方針進行的，并得到同濟醫院動物保護和使用委員會（ACUC）的批準。

 

骨形態參數

通過顯微計算機斷層掃描（μ-CT50，Scanco醫療，巴瑟爾斯多夫，瑞士）分析了左脛骨的骨形態參數和顯微結構特征。脛骨近端采用內置軟件進行三維重建，小梁參數包含骨體積/總體積比（BV/TV），小梁數量（Tb.N），小梁厚度（Tb.Th），小梁空間（Tb.Sp），骨面積/骨體積比（BS/BV），以及連通性密度（Conn.D）。

 

病態骨著色

將股骨固定于4%多聚甲醛溶液中2天。然后在0.5 M ETDA（PH=8.0）溶液中進行3周的脫鈣處理并嵌入進石蠟中。石蠟嵌入的股骨被分成5μm個部分，用伊紅（H&E）著色，并在顯微鏡（奧林巴斯，日本）下觀察。

 

免疫印跡分析

在液氮中粉碎骨組織，并在含有蛋白酶抑制劑混合物（促進劑，武漢，中國）和苯甲基磺酰氟（促進劑，武漢，中國）的RIPA裂解緩沖液（促進劑，武漢，中國）中均質化。以同樣的方式收集細胞蛋白。按照制造商的指示用BCA試劑盒測定總蛋白的濃度(促進劑，武漢，中國)。蛋白質被SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜（密理博，比勒利卡，MA, 美國）。這些膜在0.1%至20的TBS中被5%的脫脂牛奶阻斷1小時，37℃。然后對OPG抗體進行探測（稀釋1:1000，Bioworld, 中國），RANKL（稀釋1:1000，ProSci Inc., 美國），MMP 9（稀釋1:1000，Abcam, 英國），NFATc-1（稀釋1:1000，Abcam, 英國），CTSK（稀釋1:1000; Abcam,英國），總磷-65，-38，-ERK，-JNK（稀釋1:1000，細胞信號技術，美國）和GAPDH（稀釋1:4000, Abbkine, 中國）在4攝氏度下持續一整晚。第二天印跡被洗掉，在37℃下用共軛HRP二級抗體培育1小時，通過化合光可視化增強（ECL, BioRad, 美國）。使用ImageJ分析目標帶的灰值（NIH, 美國）。

 

細胞培養

從4周齡的雄性C57bl/6小鼠中分離得到原發性骨髓單核細胞。用培養液沖洗股骨和脛骨，然后采集骨髓細胞到直徑10厘米的盤中。在含10%胎牛血清的α-MEM媒介中進行細胞培養（FBS），100 U /mL青霉素，100 U /mL鏈霉素和30 ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子M-CSF（PeproTech，Rocky Hill，新澤西）。24小時后，在M-CSF存在下收集漂浮細胞，繼續培養3天。粘附細胞作為骨髓源性巨噬細胞（BMMs）以待進一步使用。BMMs保持在潮濕的培養器中（熱科學，美國），37℃，5% CO2，95%大氣。培養液每兩天補充一次。

 

細胞活性測量

細胞計數kit-8（促進劑，武漢，中國）被用來評估細胞活性。把BMMs培養在密度為5 × 103的96格孔板中的每格孔板中。在細胞粘附后，用不同濃度的復合骨膠原(GAG: 0, 0.0015, 0.0075, 0.015,0.15, 1.5 g/L)和地塞米松(DXM: 0,0.001, 0.01, 0.1, 1 μM)治療細胞96小時。然后用10% CCK-8的完全培養液代替細胞培養液。在37℃下孵化1-4小時，用多模式讀取器測量450nm處的吸光度。

 

TRAP著色

為了檢測破骨細胞的分化，BMMs暴露于100 ng/mL的RANKL（PeproTech，Rocky Hill，新澤西）和30 ng/mL的M-CSF。用不同濃度的復合骨膠原(0,0.0015, 0.0075, 0.015, 0.15, 1.5 g/L) 和地塞米松(0.1 μM) 對細胞進行治療96小時，然后根據制造商的指示用4%多聚甲醛固定，并用抗酒石酸性磷酸酶著色（TRAP）。（酸性磷酸酶，白細胞（TRAP）Kit, Sigma, 美國)。TRAP陽性細胞被認為是破骨細胞并計數。

 

RNA制備和逆轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應

根據制造商的指示，用試劑盒從破骨細胞中提取總核糖核酸（Invitrogen, 美國）。在20μL反應系統中，一個微觀的RNA通過GoScript逆轉錄系統（Promega, 美國）被反向轉錄成第一個鏈cDNA。使用循環參數如下:40個周期PF變性，在95度下15秒和60度下熱處理60秒。對每個樣品 進行了重復3次試驗。使用熒光試劑混合（試劑盒，德國）在瑞士羅氏480II燈下做定量PCR反應。通過比較周期閾值(Ct)方法測定MMP 9, CTSK, NFATc-1和RANKL等破骨細胞相關標志物的Mrna表達水平，并進行規范化至GAPDH表達水平。PCR反應引物序列見表1。

表1. 引物序列

 

統計分析

在目前研究中所有數據被報道是用平均數± 標準差比較法在兩組間使用非成對或非參數的Mann-Whitney測試完成的。所有數據均采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5.0軟件進行分析。P<0.05被認為是有意義的。

圖1 復合骨膠原對GIOP小鼠骨微結構的影響。小鼠被皮下植入60天緩釋7.5mg安慰劑丸或氫化波尼松丸，復合骨膠原灌胃。

A：從正常組、安慰劑組、氫化波尼松組和復合骨膠原組用微CT分析下的脛骨近端的三維重建。

B：微ct分析近端脛骨的參數直方圖：相對骨體積與總體積比（BV/TV）；小梁數目(Tb.N);小梁的空間(Tb.Sp);連接密度(Conn.D)。

C：在不同組中股骨H&E染色的代表圖像，比例尺為20 μm。數據表示為平均數±標準差，n=5-7/組。治療組和控制組的差異具有統計意義，結果顯示為*P<0.05, **P<0.01。

圖2 復合骨膠原抑制GIOP小鼠RANKL/OPG比率的表達。

A .GIOP小鼠中RANKL 和OPG的蛋白免疫印跡分析。

B.柱狀圖顯示氫化波尼松導致了RANKL /OPG信號通路的激活，因此促進了糖皮質激素引發的骨質疏松（GIOP）。復合骨膠原減輕骨組織中RANKL /OPG比率，從而保護小鼠免于GIOP。所有結果顯示均值± SD, n=3-5/group, *P<0.05。

 

結果

 

在GIOP小鼠體內，復合骨膠原對骨骼微結構的影響

通過顯微CT觀察左脛骨骨微結構。采用3D重建技術來直接評估骨骼結構和骨密度。通過分析包含BV/TV, Tb.N, Tb.Sp和Conn.D的骨小梁參數來計算骨骼微結構。與正常組和安慰劑組對比，在3D重建中氫化波尼松組顯示明顯的骨流失（圖1A）。在測量BV/TV, Tb.N 和 Conn.D.時顯示明顯的下降。復合骨膠原治療組，BV/TV, Tb.N 和Conn.D.參數顯著增長，且骨小梁間的間距減少（圖1B）。在脛骨H&E著色中也顯現了同樣的結果（圖1C）。復合骨膠原改善了由脫氫皮質醇導致的骨小梁流失。同時，以上結果顯示氫化波尼松降低骨密度（BMD）并使骨小梁微結構稀疏，這從而導致小鼠更容易發生骨折。通過增加骨小梁和強化骨微結構，復合骨膠原可以保護小鼠免于GCs導致的骨流失。

 

復合骨膠原影響GIOP小鼠的RANKL/OPG表達。

為了探究復合骨膠原對糖皮質激素引發骨質疏松的抑制作用的可能的潛在機理，我們首先檢查了生物化學標記血清鈣（Ca2+）和血清磷酸鹽。與正常組和安慰劑組對比而言，用氫化波尼松球團小組顯示出低濃度的血清鈣離子。復合骨膠原加強了血清鈣離子的濃度。然而，血清磷酸鹽并沒有明顯差異。接下來，我們對脛骨和腿骨中的RANKL和OPG的蛋白質水平進行了評估（圖2A），RANKL和它的誘騙受體OPG是調節骨吸收和骨形成平衡的2個重要分子。RANKL表達的增加或是OPG表達的減少會導致破骨細胞進一步分化和活躍[12,13]。在GIOP小鼠中，非常有趣的是氫化波尼松誘發了RANKL的嚴重過表達，而非OPG的表達（圖2B）。在復合骨膠原組中RANKL的增強表達和OPG的抑制表達均得到了緩解。

 

復合骨膠原抑制了BMMs中破骨細胞的分化。

接下來將研究BMMs對GCs、復合骨膠原和骨質疏松之間的關系。地塞米松，復合骨膠原影響了BMMs的抗毒性（圖3A）。顯著的是從0μM到 1μM地塞米松組劑量依賴破骨細胞分化（圖3B）。TRAP+細胞的數量和區域隨地塞米松的增加而增加（圖3C）。當增加復合骨膠原時，TRAP+細胞的數量和區域下降且無細胞毒性（圖3D和3E）。因此，GCs促進了破骨細胞的分化和發育，但是受復合骨膠原的影響得到抑制。

 

圖3  在BMMs中，復合骨膠原抑制破骨細胞的分化。

A.對于BMMs可用性上，地塞米松和復合骨膠原的不同濃度。

B.4天的地塞米松(0, 0.001, 0.01, 0.1,1μM)和RANKL (100 ng/ml)的BMMs的TRAP著色。箭頭表明TRAP+多核破骨細胞。

C. 每孔中TRAP+細胞數量。顯示數據的平均值± SD, n=3. 

D. 4天的地塞米松(0.1 μM)，復合骨膠原(0, 0.0015, 0.0075, 0.015, 0.15, 1.5 g/L)和RANKL (0.1 μM)的BMMs的Trap著色。箭頭顯示TRAP+多核破骨細胞。

E. 每孔中TRAP+細胞數量。顯示數據的平均值± SD, n=3 *P<0.05; **P<0.01. 基準尺: 500 μm.

 

圖4 復合骨膠原抑制RANKL誘發的NF-kB and MAPK通路。BMMs用M-CSF (30 ng/ml)培養，細胞用地塞米松共同培養，使用或不使用復合骨膠原培養24小時，之后用RANKL (100 ng/ml) 刺激細胞 0 分鐘，15 分鐘， 30 分鐘和 60分鐘。用蛋白免疫印跡來測量數種基因中蛋白質水平。

A.在15分鐘時 p65 (p-p65)磷酸化表達增加，經地塞米松刺激后的1小時內減少。在復合骨膠原組中，p-p65總體水平降低。

B.MAPK通路亞科(p-ERK, p-JNK, p-p38)呈現與p65磷酸化表達相似的趨勢。

 

復合骨膠原抑制RANKL誘發的NF-kB 和 MAPK通路。

考慮到NF-kB通路在RANKL促進破骨細胞分化中扮演著重要的角色，因此，我們下一步調查復合骨膠原對RANKL誘發NF-kB 和 MAPK通路活性的效果。如圖4所示的通路，在15分鐘時，復合骨膠原抑制了由地塞米松誘發的磷酸化p65的增長。在MAPK通路中，顯示出了同樣的效果。磷酸化p38的增長證實，在RANKL存在的ERK 和 JNK的地塞米松組，受復合骨膠原的抑制影響。

 

復合骨膠原抑制了破骨細胞分化的相關重要分子的表達

最終，我們發現，地塞米松組中NF-kB和MAPK通路有增長。這是由復合骨膠原抑制的結果。這個結果提示我們去檢查它的下游信號分子NFATc-1和c-fos。由蛋白質印記和逆轉錄聚合酶反應分析得出復合骨膠原顯著的抑制了NFATc-1 和 c-fos的表達。接下來我們檢查了測到的NFATc-1、靶向的MMP 9 and CTSK。并發現，復合骨膠原在他們的表達中起著抑制的作用。地塞米松激活了下游基因NFATc-1, c-fos, MMP 9和CTSK，結果促進了破骨細胞分化和骨質疏松的發展。然而，復合骨膠原通過抑制GCs誘發的破骨細胞分化從而抑制了這一效果（圖5）。

 

討論

在中國復合骨膠原被認為是健康的食品，且它們對提高骨質量和骨強度的作用為大眾熟知。在切除卵巢的小鼠中，復合骨膠原加強了股骨生物力學指數，如最大的負荷量、抗壓力和彈性模量。然而，它們對于GIOP的作用不詳。本次研究主要專注于復合骨膠原對GIOP小鼠的作用。已公認，GCs的內源性和生理劑量調節成骨細胞分化并最終抑制破骨細胞的活性來維持骨形成和骨吸收的平衡。過多的GCs有著相反的作用，它將妨礙骨骼體內平衡并導致骨質疏松[15]。因為高劑量的GCs治療會導致繼發性骨質疏松，這限制了他們的臨床應用。RANKL是一個至關重要的因子，它調節GIOP中破骨細胞的分化和活性。與受體RANK結合，RANKL開始補充適當的分子，如：TRAFs, 尤其是 TRAF-6，接著激活下游NF-kB信號通路，從而調節NFATc-1和它的靶向基因MMP 9和 CTSK的表達，這樣就促進了破骨細胞的分化和骨質疏松[16]。RANKL或RANKL/OPG比率的表達的增加改變了骨骼體內平衡，最終導致骨質疏松[17, 18]。RANKL的減少減弱了破骨細胞分化和骨吸收過程。以前的研究表明了RANKL對破骨細胞分化的抑制作用（OPGFc蛋白、RANKL抑制劑狄諾塞麥），主要是絕經后骨質疏松[12, 19]。在這次研究中，我們證實，氫化波尼松治療的小鼠RANKL和 RANKL/OPG比例的減少，可能解釋了GIOP中復合骨膠原的保護作用。

圖5 復合骨膠原抑制與破骨細胞分化相關的重要分子的表達。BMMs在RANKL (100 ng/ml) 和M-CSF(30 ng/ml)中培養。在不同組中加入地塞米松(0.1 μM)或復合骨膠原(1.5 g/L)，細胞培養2或4天。幾個基因的mRNA的表達由RT-PCR量化。蛋白質含量由免疫印跡檢測。

A.數個標記轉基因水平的RTPCR分析與NF-kB 和 MAPK信號通路相關聯。

B.NFATc-1, c-fos,MMP 9, CTSK的蛋白表達免疫印跡分析。顯示數據的平均值± SD, n=3。

C.NFATc-1, c-fos, MMP 9和CTS的定量標準化到GAPDH. *P<0.05。

 

NFATc-1是鈣調磷酸酶和Ca2+管控的轉錄因子，受RANKL誘發明顯。在破骨細胞生成期間，RANKL 與 RANK的結果導致了NFATc-1通過NF-kB信號通路時的脫磷酸作用。因此，細胞核移位，加強了破骨細胞關聯基因如MMP 9和CTSK的轉錄與翻譯。因此影響了破骨細胞的分化和骨質疏松[20, 21]。MMP 9是一種酶，屬于鋅-金屬蛋白酶家族，涉及ECM降級。在骨組織中，MMP 9由破骨細胞生成，有著降級和改變骨骼中ECM的能力。因此，參與骨吸收和骨重建生理及病變過程[22, 23]。作為溶酶體的半胱氨酸蛋白酶，主要在破骨細胞中表達。CTSK也能夠引誘ECM降級。CTSK不足會導致骨質疏松為特征的致密度成骨不全癥紊亂[24]。

 

我們證實復合骨膠原是通過抑制RANKL/OPG通路保護小鼠免于GIOP。復合骨膠原治療組的骨小梁數量及連接性有提高。我們進一步觀察發現在RANKL存在的情況下，復合骨膠原治療BMMs時，磷酸化-65和-38的表達減少。同時，曾使用復合骨膠原治療的BMMs中發現向下調節下游分子NFATc-1, c-fos, MMP 9 和CTSK。體內OPG表達的增加和RANKL表達的減少以及體外NF-kB 與MAPK信號通路的抑制，清晰的表明復合骨膠原是通過NF-kB和MAPK信號通路使小鼠免于GIOP。RANKL表達的減少和OPG表達的增強抑制了NF-kB和MAPK信號通路，因此影響了NFATc-1和c-fos的轉錄，最終導致MMP 9 和 CTSK的向下調節。結果是，破骨細胞分化和ECM降級得到緩解，因此改善了GC誘發的骨質疏松。

 

在這個研究中，我們證實了GCs對破骨細胞分化的重要影響。復合骨膠原通過NF-kB和 MAPK信號通路抑制GC誘發的骨質疏松。GCs在藥理學劑量誘發骨質疏松不僅僅是破骨細胞的結果，同時也是成骨細胞和骨細胞的結果[25]。過多的GCs抑制成骨細胞的分化和增值，同時促進了成骨細胞的凋亡[26]。先前的研究顯示抑制成骨細胞分化和增值與Wnt信號向下調節β-連環蛋白和RUNX2轉錄因子的減少息息相關[27]。另一個重要的調節者是BMP2，它被證實在曾接受藥理學劑量GCs的小鼠中被抑制了。β-連環蛋白，RUNX2 或BMP2的減少導致造骨新生的減少和MSCs向脂肪細胞分化[28]。此外，治療劑量的GCs誘發骨細胞自我吞噬和凋亡，同時也減小了骨細胞的生存能力[8, 29]。促凋亡激酶的活化或骨細胞中的自噬體的產生，細胞毒性環境的創造，導致細胞凋亡和死亡。然而，是否是骨細胞中的自我吞噬的抑制削弱了GIOP還有待研究[30]。

 

總而言之，我們的研究清晰的表明復合骨膠原對糖皮質激素誘發的骨質疏松具有保護作用。相關聯的機理是RANKL表達的減少以及NF-kB和 MAPK通路的抑制有關。這項研究為臨床環境減弱GIOP提供了一些理論基礎和潛在療法。然而，還需要進一步的研究來評估復合骨膠原對成骨細胞或骨細胞影響，及進一步探索潛在的保護效果的分子機制。

 

感謝

本項工作由中國國家自然科學基金會（補助金81570669, 81200521, 81570615）和武漢衛生和計劃生育委員會（補助金grants 2016whzqnyxgg02）提供支持。

 

揭露利益沖突

無

 

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